Phát hiện con đường thải độc não bộ bằng MRI tăng cường độ tương phản

Xuất bản: 2013 22 tháng 2

Nội dung chính [hiện]

Tác giả: Jeffrey J. Iliff,  Hedok Lee,  Mei Yu,  Tian Feng,  Jean Logan,  Maiken Nedergaard và Helene Benveniste 

Nguồn tài liệu: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3582150/

Tổng quan

Hệ thống glymphatic là một con đường cận mạch trên toàn não được xác định gần đây để trao đổi dịch não tủy (CSF) và dịch kẽ (ISF), tạo điều kiện giải phóng hiệu quả các chất hòa tan và chất thải từ não. CSF đi vào não dọc theo các kênh cạnh động mạch để trao đổi với ISF, sau đó được loại bỏ khỏi não theo con đường cạnh tĩnh mạch. Bởi vì độ thanh thải amyloid β hòa tan phụ thuộc vào chức năng của con đường glymphatic, chúng tôi đề xuất rằng sự thất bại của hệ thống thanh thải này góp phần vào sự lắng đọng mảng bám amyloid và tiến triển bệnh Alzheimer. Ở đây chúng tôi cung cấp bằng chứng về khái niệm rằng chức năng đường dẫn glymphatic có thể được đo bằng kỹ thuật hình ảnh phù hợp về mặt lâm sàng. MRI tăng cường độ tương phản động đã được sử dụng để hình dung sự trao đổi CSF-ISF trên não chuột sau khi sử dụng chất tương phản thuận từ trong nội mô. Các đặc điểm chính của chức năng con đường glymphatic đã được xác nhận, bao gồm trực quan hóa dòng CSF cạnh động mạch và trao đổi CSF-ISF phụ thuộc vào kích thước phân tử. Hình ảnh toàn bộ não cho phép xác định hai nút dòng chính ở hốc tuyến yên và tuyến tùng, trong khi MRI động cho phép xác định các thông số động học đơn giản để mô tả sự trao đổi CSF-ISF glymphatic và độ thanh thải chất tan từ não. Chúng tôi đề xuất rằng phương pháp MRI này có thể cung cấp cơ sở cho một chiến lược hoàn toàn mới để đánh giá mức độ nhạy cảm và tiến triển của bệnh Alzheimer trong não người sống.

• Bệnh tự kỷ, giảm trí nhớ và sương mù não: Thải độc Hệ bạch huyết vùng đầu như thế nào?
• Hệ thống bạch huyết: Đánh giá về tác động của nắn chỉnh xương
• Lập bản đồ hệ thống bạch huyết trên các quy mô cơ thể và các lĩnh vực chuyên môn: Báo cáo từ hội thảo của Viện Tim, Phổi và Máu Quốc gia năm 2021 tại Hội nghị chuyên đề về bạch huyết Boston
• Hệ bạch huyết và hạch canh gác: đường dẫn ung thư di căn
• Cấu trúc và sinh lý mạng lưới mạch bạch huyết – Phần 8: Bạch huyết đường liêu hóa và liệu pháp miễn dịch

Giới thiệu

Trong mô hình cổ điển, dịch não tủy (CSF) được tiết ra tích cực bởi đám rối màng mạch của não thất và di chuyển theo dòng khối hoặc theo nhịp qua hệ thống não thất, chảy từ não thất thứ tư vào khoang dưới nhện qua lỗ Luschka và lỗ của Magendie. Từ khoang dưới nhện, dịch não tủy được cho là sẽ được tái hấp thu vào dòng máu thông qua các hạt màng nhện của xoang màng cứng hoặc bằng cách đi ra khỏi khoang sọ dọc theo các bao dây thần kinh sọ để được đào thải qua bạch huyết cổ. Chuyển động của chất lỏng dọc theo cột CSF này thường được đo bằng MRI. MRI tương phản pha cho phép hình dung động lực dòng chảy dịch não tuỷ và được sử dụng trên lâm sàng để đánh giá não úng thủy thông thương so với không thông thông, não úng thủy áp lực bình thường và u nang màng nhện. Chụp cộng hưởng từ tăng cường chất tương phản cũng có thể được sử dụng để xác định rò rỉ dịch não tủy trong điều trị hạ huyết áp nội sọ tự phát hoặc chảy nước mũi dịch não tủy.

Trong một nghiên cứu gần đây, chúng tôi đã báo cáo rằng, trái ngược với mô hình trong sách giáo khoa về bài tiết và tái hấp thu CSF, một tỷ lệ lớn CSF dưới nhện tuần hoàn qua nhu mô não dọc theo các khoang cạnh mạch máu và trao đổi với dịch kẽ (ISF) (một quá trình được đề cập ở trên). ở đây dưới dạng trao đổi CSF-ISF). Dòng chất lỏng dọc theo các tuyến cận mạch này và qua kẽ được hỗ trợ bởi sự di chuyển của nước xuyên qua các kênh nước aquaporin-4 (AQP4) của tế bào hình sao và tạo điều kiện cho việc thanh thải hiệu quả các chất hòa tan trong kẽ, bao gồm cả amyloid β hòa tan, từ nhu mô não. Mô tả ban đầu của chúng tôi về con đường này, mà chúng tôi gọi là hệ thống glymphatic, dựa trên hình ảnh huỳnh quang 2-photon in vivo và ex vivo. Phân tích các lát não ex vivo cho thấy rằng con đường này đại diện cho một hệ thống giải phẫu toàn bộ não để tạo điều kiện thuận lợi cho việc loại bỏ hiệu quả các chất hòa tan và chất thải kẽ; tuy nhiên, những hạn chế của phương thức hình ảnh dựa trên huỳnh quang đã ngăn cản việc đánh giá trực tiếp động lực học dòng CSF-ISF trên toàn não theo cách 3D.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng MRI tăng cường độ tương phản để hình dung sự trao đổi CSF-ISF dưới nhện trên toàn bộ não trong não chuột sống. Trước tiên, chúng tôi xác nhận các đặc điểm chính của con đường được mô tả trong nghiên cứu ban đầu của chúng tôi (6), bao gồm dòng chất đánh dấu CSF dưới nhện phụ thuộc vào dòng chảy lớn dọc theo các tuyến đường cạnh động mạch và sự di chuyển của chất đánh dấu vào và qua nhu mô não. Chúng tôi sử dụng tính chất 3D vốn có của MRI, kết hợp với các phương thức xử lý khác nhau bao gồm phân tích cụm, để lập bản đồ đường trao đổi CSF-ISF trong não theo thời gian và để xác định các “nút” dòng giải phẫu quan trọng và các tuyến thanh thải từ nhu mô não. Quan trọng nhất, chúng tôi xác định các thông số động học đơn giản mô tả dòng vào và độ thanh thải của các chất tương phản thuận từ trong toàn bộ thể tích não. Do vai trò quan trọng của con đường này trong việc thanh thải amyloid β hòa tan khỏi nhu mô não (6), chúng tôi đề xuất rằng phương pháp định lượng MRI tăng cường độ tương phản này có thể tạo cơ sở cho một chiến lược hoàn toàn mới để đánh giá tính nhạy cảm của bệnh Alzheimer (AD) và tiến triển của bệnh.

Kết quả

Tất cả chuột tham gia nghiên cứu vẫn ổn định về mặt sinh lý trong suốt thí nghiệm chụp ảnh kéo dài 6 giờ, với nhịp thở trong khoảng 50 đến 60 nhịp thở mỗi phút, độ bão hòa O ₂ khoảng 98%–100%, nhịp tim khoảng 300–370 nhịp mỗi phút và nhiệt độ cơ thể từ 36,5°C đến 37,5°C. Một số cấu trúc giải phẫu chính, chẳng hạn như khứu giác, hồi hải mã, tuyến tùng, củ trên, củ dưới, tuyến yên và tiểu não, có thể được xác định, mặc dù độ tương phản chất xám-trắng bị hạn chế trong chuỗi 3D FLASH T1-weighted thu được trước khi sử dụng chất tương phản thuận từ (Hình​(Hình 1,1, A và B). Các động mạch lớn hơn, chẳng hạn như động mạch khứu giác, các nhánh của động mạch não trước, các động mạch azygos quanh quả cầu, các động mạch trán trong giữa và phức hợp động mạch màng mạch sau ngoài, có thể dễ dàng nhìn thấy trên mặt phẳng dọc gần đường giữa (Hình 1,1, A và B).

Hình 1: Dòng chảy cận mạch của chất tương phản thuận từ.

(A) Hình ảnh 3D của các cấu trúc giải phẫu quan trọng trong não chuột trước khi sử dụng chất cản quang. Các cấu trúc giải phẫu bao gồm tuyến yên (xanh nhạt), hồi hải mã (xanh lá cây), colliculus trên (màu cam), colliculus dưới (xanh đậm), tuyến tùng (màu vàng) và các đoạn động mạch liên quan (màu đỏ). Động mạch khứu giác (OA), các azygos của động mạch não trước (azACA), azygos pericallosalđộng mạch (AzPA), động mạch trán trong giữa (IFA) và phức hợp động mạch màng đệm bên sau đã được hình dung. 

(B) Ảnh MRI 2 chiều T1W với các cấu trúc giải phẫu được mã hóa màu được hiển thị. 

(C – E) Chuỗi thời gian cho thấy sự xâm nhập sớm của chất tương phản thuận từ có trọng lượng phân tử nhỏ Gd-DTPA (MW 938 Da). 

(C) Thời gian mà Gd-DTPA được truyền vào bên trong vỏ xuất hiện trong bể chứa nước magna được xác định là 0 phút

(D và E) phần sớm nhất của quá trình dòng vào được thể hiện trong các khung thời gian tiếp theo và cho thấy rằng Gd-DTPA đi vào não theo con đường cận mạch.

(F – H) Chuỗi thời gian động của dòng chất tương phản thuận từ có trọng lượng phân tử lớn GadoSpin (MW 200 kDa) tràn vào sớm cũng cho thấy sự vận chuyển vào não là cận mạch. Lưu ý rằng rõ ràng là mặc dù 2 chất tương phản thuận từ khác nhau về trọng lượng phân tử, nhưng chúng đi qua các ống dẫn cạnh mạch máu với tốc độ tương tự nhau, chứng minh rằng dòng dịch não tủy chi phối quá trình này. 

(I và J) Sự vận chuyển cạnh mạch của chất tương phản thuận từ được thể hiện đặc biệt rõ ràng ở mức Vòng Willis dọc theo động mạch cảnh trong (IC), động mạch thông sau (Pcom) và động mạch ổ mắt trán bên. Thanh tỷ lệ: 3 mm.

Dòng chảy cận mạch của chất tương phản thuận từ.

Trong một nghiên cứu gần đây sử dụng hình ảnh dựa trên huỳnh quang, chúng tôi đã chứng minh rằng, ở chuột, CSF từ khoang dưới nhện nhanh chóng xâm nhập vào não thông qua các khoang Virchow-Robin, dọc theo các kênh cạnh động mạch để trao đổi với khoang ISF (6). Dòng dịch não tủy “ngược dòng” rộng rãi như vậy vào nhu mô não là trái ngược với mô hình cổ điển về bài tiết và tái hấp thu dịch não tủy (1, 2 ). Trong nghiên cứu này, mục tiêu đầu tiên của chúng tôi là xác định xem liệu dòng CSF cận mạch vào não có thể được quan sát bằng MRI tăng cường độ tương phản sau khi cung cấp các chất tương phản thuận từ khác nhau vào trong vỏ hay không. 

Nhân vật​Hình 11cho thấy dòng diethylenetriaminepentaacetate trọng lượng phân tử nhỏ (Gd-DTPA) tràn vào ​(Hình 1,1, C–E) và Gd-chelate polyme có trọng lượng phân tử lớn (GadoSpin) ​(Hình 1,1, F–H) trong thời gian truyền dịch sớm ở 2 con chuột đại diện. Chuỗi thời gian động của MRI T1 cho thấy rõ ràng các lộ trình giải phẫu phụ thuộc thời gian của dòng chảy cận mạch, bao gồm (a) sự xuất hiện của chất tương phản thuận từ trong bể chứa magna ​(Hình 1,1, C và F) và vận chuyển dọc theo động mạch nền ​(Hình 1,1, D và G), (b) sự xuất hiện độ tương phản ở hốc tuyến yên ​(Hình 1,1, D và G), (c) tiếp tục vận chuyển dọc theo phức hợp động mạch khứu giác và vào khứu giác ​(Hình 1,1, E và H), và (d) vận chuyển qua phức hợp động mạch màng đệm sau (Hình 1A)1A) tới hốc quả tùng. Các video về chuỗi thời gian động ghi lại sự vận chuyển qua hệ thống glymphatic của Gd-DTPA và GadoSpin thể hiện rõ ràng sự khác biệt trong sự phân bố trên toàn bộ não của phân tử nhỏ và lớn hơn (Video bổ sung 1 và 2 và các Phương pháp bổ sung; tài liệu bổ sung có sẵn trực tuyến với điều này bài viết; doi: 10.1172/JCI67677DS1 ). Ví dụ, những thay đổi tín hiệu do GadoSpin gây ra xuất hiện và ưu tiên tồn tại dọc theo các ống dẫn cạnh động mạch/cạnh mạch, và sự hấp thu của nhu mô rất thưa thớt; trong khi chất tương phản Gd-DTPA có trọng lượng phân tử nhỏ có khả năng tiếp cận nhu mô não lan tỏa hơn nhiều (so sánh Video bổ sung 1 và 2 và xem Phương pháp bổ sung). Cũng có bằng chứng cho thấy rằng, mặc dù trọng lượng phân tử của 2 chất tương phản thuận từ là khác nhau, nhưng việc đi qua các ống dẫn cạnh mạch máu phần lớn giống nhau kể từ thời điểm chất tương phản xuất hiện trong bể lớn (được định nghĩa là “0 phút” trong Hình 1,1, C và F). Có một số biến đổi về mức độ tương phản thuận từ xuất hiện trong hốc quả tùng; và không quan sát thấy sự thay đổi tín hiệu ở hốc quả tùng ở 2 động vật được tiêm Gd-DTPA. Tuy nhiên, bản chất cận mạch của dòng chảy dọc theo con đường glymphatic rõ ràng nhất ở mức độ của Vòng Willis, nơi tín hiệu cường độ cao vạch ra lối ra của các động mạch thông sau ​(Hình 1I),1I), cũng như dọc theo động mạch trán ổ mắt bên ​(Hình 11J).

Dựa trên chuỗi thời gian động, rõ ràng là, mặc dù Gd-DTPA và GadoSpin khác nhau về trọng lượng phân tử hơn 2 bậc độ lớn, nhưng chúng dường như vận chuyển các ống dẫn cạnh mạch máu với tốc độ gần như tương tự nhau ​(Hình 1,1, C–H). Chất cản quang dường như di chuyển chậm chạp qua hốc quả tùng, thường tồn tại trong bể này ngay cả sau hơn 2 giờ trôi qua (Video bổ sung 1 và 2 và các phương pháp bổ sung). Quan sát cho thấy sự di chuyển của thuốc cản quang cạnh mạch máu không khác biệt đáng kể dựa trên trọng lượng phân tử của tác nhân phù hợp với sự vận chuyển chất lỏng qua trung gian dòng chảy khối, được biết là không phụ thuộc vào kích thước phân tử ( 7 ). Sử dụng MRI tăng cường độ tương phản, những dữ liệu này xác nhận phát hiện cơ bản đầu tiên trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi ( 6 ), rằng dòng dịch não tủy từ khoang dưới nhện vào nhu mô não xảy ra chủ yếu dọc theo con đường cạnh động mạch.

Ảnh hưởng của kích thước phân tử đến sự vận chuyển Gd-DTPA và GadoSpin trên toàn bộ não.

Trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi, chúng tôi đã báo cáo rằng, mặc dù cả chất đánh dấu trọng lượng phân tử nhỏ và lớn đều có thể di chuyển dọc theo con đường dòng chảy gần động mạch, việc tiếp cận từ không gian cạnh động mạch vào kẽ não xung quanh bị hạn chế dựa trên kích thước phân tử ( 6 ). Cụ thể là, các chất đánh dấu trọng lượng phân tử nhỏ hơn, chẳng hạn như dextran liên hợp Texas Red (MW 3 kDa) (TR-d3) hoặc chất đánh dấu ovalbumin liên hợp Alexa Fluor 647 (MW 45 kDa), dễ dàng được truyền vào kẽ, trong khi các chất đánh dấu trọng lượng phân tử lớn hơn, chẳng hạn như như dextran 2.000-kDa liên hợp FITC (FITC-d2000, MW 2.000 kDa), vẫn bị giới hạn trong các khoang cạnh mạch máu. Chúng tôi phỏng đoán rằng các chân cuối của tế bào hình sao chồng lên nhau, bao bọc hoàn toàn vi tuần hoàn não ( 8 ), có chức năng hạn chế sự tiếp cận của các chất có trọng lượng phân tử lớn hơn từ kẽ ( 6 ). Dựa trên những phát hiện này, chúng tôi dự đoán rằng, nhờ khả năng tiếp cận tốt hơn vào kẽ não, Gd-DTPA (MW 938 Da) dự kiến ​​sẽ tạo ra những thay đổi tín hiệu (rút ngắn T1) trong tổng thể tích mô não lớn hơn so với thể tích mô não lớn hơn. Phân tử GadoSpin (MW 200 kDa). Chúng tôi đã thử nghiệm giả thuyết này bằng cách sử dụng các chiến lược xử lý hình ảnh định lượng khác nhau.

Trước tiên, chúng tôi đo tổng “thời gian tiếp xúc” của chất tương phản thuận từ tại các vị trí giải phẫu quan trọng gần các ống dẫn dòng vào cận mạch lớn, trong đó sự hấp thu chất tương phản được hình dung rõ ràng theo thời gian. Cụ thể, ROI được chia thành các ống dẫn dòng glymphatic gần nhất (tức là hốc tuyến yên và hốc tuyến tùng) và ROI “nhu mô”, chẳng hạn như nhân cầu não, tiểu não, khứu giác và ống dẫn nước. Để so sánh động học tương đối trong các tiểu vùng này, các đường cong “hoạt động” thời gian trung bình (TAC) của Gd-DTPA và GadoSpin đã được tính toán và vẽ trong ​Hình 2.2. Trong phần lõm của tuyến yên, các đợt thay đổi cường độ tín hiệu trung bình do Gd-DTPA và GadoSpin gây ra gần như giống hệt nhau trong toàn bộ thời gian nghiên cứu ​(Hình 2A). Những phát hiện tương tự cũng được quan sát thấy ở hốc tuyến tùng ​(Hình 2B). Điều này xác nhận rằng trong các phần gần nhất của con đường glymphatic, được định nghĩa là các khoang dưới nhện và các kênh cận mạch máu gần, việc tiếp cận và dòng chất tương phản phần lớn không phụ thuộc vào kích thước phân tử. Ngược lại, TAC trung bình của Gd-DTPA và GadoSpin trong tiểu não ​(Hình 2C), cống dẫn nước ​(Hình 2E) và nhân cầu não (Hình 2F) đã chứng minh sự khác biệt rõ ràng giữa các tác nhân về tốc độ dòng vào, thời gian đạt cực đại và tốc độ dòng chảy. Trong mỗi trường hợp, dòng GadoSpin có trọng lượng phân tử lớn tràn vào các khu vực này tụt hậu đáng kể so với Gd-DTPA. Ví dụ, ở những con chuột được truyền Gd-DTPA, sự hấp thu trung bình ở tiểu não đạt đỉnh điểm vào khoảng 90 phút sau khi tiêm, trong khi đó ở những con chuột được truyền GadoSpin, sự hấp thu trung bình ở mô tiểu não đạt đến mức ổn định rõ ràng vào khoảng 120 phút sau khi tiêm.

Hình 2: Vận chuyển Gd-DTPA và GadoSpin dọc theo con đường glymphatic.

TAC trung bình cho Gd-DTPA (vòng tròn màu xanh) và GadoSpin (vòng tròn màu đỏ) được hiển thị cho (A) hốc tuyến yên, (B) hốc tuyến tùng, (C) tiểu não, (D) khứu giác, (E) cống dẫn nước, và (F) nhân cầu não. Vị trí của từng ROI được hiển thị trên biểu tượng não dọc ở góc trên cùng bên phải của mỗi biểu đồ. (A và B) Rõ ràng là sự hấp thu chất tương phản trong hốc tuyến yên và hốc tuyến tùng phần lớn tương tự đối với Gd-DTPA và GadoSpin. Điều này xác nhận rằng trong các phần gần nhất của con đường glymphatic, việc vận chuyển chất tương phản thuận từ phần lớn không phụ thuộc vào kích thước phân tử. Rõ ràng là sự hấp thu mô của Gd-DTPA cao hơn rõ rệt so với GadoSpin ở (C) tiểu não, (E) cống dẫn nước và (F) nhân cầu não. Điều này xác nhận rằng sự di chuyển của chất tương phản từ đường cận mạch máu/dưới nhện vào và qua kẽ não thực sự phụ thuộc vào kích thước phân tử. Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± SEM.

Giá trị AUC trung bình (mAUC), phản ánh tốc độ truyền và hấp thu, cũng được tính cho Gd-DTPA và GadoSpin trong mỗi khu vực này. Tại thời điểm tuyến yên nghỉ ngơi, mAUC thu được từ Gd-DTPA và GadoSpin lần lượt là 743% ± 266% mức thay đổi tín hiệu trong mỗi khoảng thời gian và 685% ± 217% mức thay đổi tín hiệu trong mỗi khoảng thời gian ( P = 0,45). Vì tổng lượng chất tương phản thuận từ đi qua hốc tuyến yên khác nhau giữa các con chuột trong mỗi nhóm, để giảm thiểu sự thay đổi khi so sánh sự hấp thu chất tương phản thuận từ của mô trong và giữa các nhóm, tất cả các mAUC khu vực đã được chuẩn hóa thành mAUC của hốc tuyến yên (đại diện cho nhiều nhất phần gần nhất của con đường glymphatic và “nguồn” phân phối chất cản quang chính). ​Bảng 11 cho thấy kết quả phân tích tỷ lệ mAUC khu vực và chứng minh rằng sự hấp thu mô của Gd-DTPA cao hơn đáng kể so với GadoSpin trong tiểu não, ống dẫn nước và nhân cầu não.

Bảng 1: Sự khác biệt về tổng mức hấp thu mô giữa những con chuột được tiêm Gd-DTPA và những con chuột được tiêm GadoSpin

Là phương pháp tiếp cận phi tham số thứ hai để phân tích mô hình phân phối và hấp thu mô não của Gd-DTPA so với GadoSpin, chúng tôi đã thực hiện phân tích cụm trên một loạt 4 lát cắt dọc ở đường giữa ở cấp độ cống dẫn nước từ mỗi con vật. Kết quả phân tích này được thể hiện trong Hình 3.3. Bốn cụm ( K = 4) đã được sử dụng để hiển thị tối ưu các ống dẫn quanh mạch máu. Các cụm khác nhau được liên kết với các vùng giải phẫu khác nhau, bao gồm mô liên kết trực tiếp với vùng cận mạch máu (vùng 1), mô liền kề với vùng 1 (vùng 2) và các điểm ảnh ba chiều được dán nhãn ở xa nhất bên cạnh vùng 2 (vùng 3). Mô hình phân bố của các cụm và vùng tương ứng được thể hiện trong ​Hình 3.3. Như thể hiện trong ​Hình 3B, vùng cận mạch 1 của chuột GadoSpin bao gồm các cụm màu đỏ và màu cam; và như thể hiện trong hình​Hình 3,3, C và D, các cụm màu xanh lá cây và xanh lam lần lượt bao gồm vùng 2 và vùng 3, và đại diện cho các con đường glymphatic nhu mô chậm hơn, chẳng hạn như bóng khứu giác và mô liền kề với hốc tuyến yên và hốc tuyến tùng. TAC của 4 cụm từ chuột GadoSpin cho thấy các ống dẫn cận mạch gần nhất (cụm màu đỏ và màu cam) được thể hiện bằng sự thay đổi tín hiệu cao nhất (thay đổi tín hiệu> 300% so với đường cơ sở) khi so sánh với các cụm màu xanh lá cây và xanh lam, và, hơn nữa, chúng đại diện cho ngăn nhỏ nhất (Hình 33)

Hình 3: Phân bố không gian dựa trên cụm của Gd-DTPA và GadoSpin trong não chuột.

(A) Phần đường giữa dọc có trọng số T1 ở ngang mức cống (Aq), với các mốc giải phẫu được hiển thị trước khi sử dụng GadoSpin. BA, động mạch nền; BC, bể chứa cơ bản; Cb, tiểu não; GA, tĩnh mạch Galen; Ob, khứu giác; Pin, tuyến tùng; Hố, tuyến yên. 

(B) Phân tích cụm ở chuột GadoSpin. Cụm cạnh mạch máu được phủ lên trên MRI tương ứng, chứng minh rằng các cụm màu đỏ và màu cam khớp với vị trí không gian của bể nền, hốc quả tùng và hốc tuyến yên, và mô ở vùng lân cận của các động mạch chính. 

(C) Phân phối các cụm màu xanh lam và xanh lục từ cùng một con chuột GadoSpin, chứng tỏ vị trí nhu mô nhiều hơn của các cụm này. 

(D) Tất cả các cụm được hiển thị đồng thời và phủ lên MRI. Các cụm màu đỏ và màu cam trong ống cạnh mạch máu được phân loại là vùng 1, cụm màu xanh lá cây được phân loại là vùng 2 và cụm màu xanh lam được phân loại là vùng 3.

(E) MRI T1W ở ngang mức cống, với thông tin giải phẫu các mốc được hiển thị từ một con chuột trước khi dùng Gd-DTPA. 

(F) Cụm cận mạch, vùng 1 được hiển thị từ chuột Gd-DTPA. 

(G) Phân bố cụm màu xanh lục và xanh lam ở chuột Gd-DTPA. 

(H) Hiển thị cả 4 cụm. Các cụm màu đỏ, lục và lam lần lượt được phân loại là vùng 1, 2 và 3. Thanh tỷ lệ: 3 mm. TAC cho mỗi trong số 4 cụm cho

(I) chuột GadoSpin

(J) chuột Gd-DTPA được hiển thị cùng với tổng số điểm ảnh ba chiều của mỗi cụm.

Ở chuột Gd-DTPA, phân tích cụm tương tự cho kết quả là các cụm được phân bổ giữa 3 vùng giải phẫu chính; tuy nhiên, về tổng thể, nó bao gồm nhiều mô não hơn khi so sánh với chuột GadoSpin. Như thể hiện trong ​Hình 3,3, ở chuột Gd-DTPA, các cụm màu đỏ nằm trong các ống dẫn cạnh mạch máu, như được quan sát thấy ở chuột GadoSpin (so sánh Hình 3B và ​Hình 3F), và các cụm màu xanh lá cây được liên kết với các vùng mô sâu hơn, chẳng hạn như khứu giác và tiểu não ​(Hình 3G). Tuy nhiên, trái ngược với chuột GadoSpin, các điểm ảnh ba chiều màu xanh lam của chuột Gd-DTPA bao gồm hầu hết nhân tiểu não và nhân cầu não (Hình 3,3, G và H), cho thấy rằng GadoSpin có trọng lượng phân tử lớn không thể tiếp cận không gian kẽ não dễ dàng như Gd-DTPA có trọng lượng phân tử nhỏ. TAC của 4 cụm khác nhau từ chuột Gd-DTPA được hiển thị trong ​Hình 3J. Thời gian đạt đến đỉnh điểm của cụm đỏ cận mạch là khoảng 90 phút, tương tự như thời gian quan sát được đối với cụm đỏ cận mạch của chuột GadoSpin. Nói cách khác, sự vận chuyển cận mạch của Gd-DTPA và GadoSpin có chung động lực học.

Các kết quả định lượng của phân tích cụm cho chuột Gd-DTPA và GadoSpin được trình bày trong Bảng 2.2. Điều này bao gồm tổng số điểm ảnh ba chiều trung bình của mỗi cụm thu được từ 4 lát não dọc giữa có trong phân tích và AUC của 3 TAC cụm/vùng khác nhau × sản phẩm số voxel cho mỗi cụm/vùng. Như có thể thấy từ ​Bảng 2,2, số lượng voxels được phân bổ cho vùng 1 (khu vực cận mạch máu) nằm trong phạm vi tương tự đối với chuột Gd-DTPA và GadoSpin. Tuy nhiên, ở chuột Gd-DTPA, tổng số điểm ảnh ba chiều trung bình ở vùng 3 (các điểm ảnh ba chiều màu xanh lam trong ​Hình 3D) cao hơn đáng kể so với chuột GadoSpin (các điểm ảnh ba chiều màu xanh lam trong Hình 3H; P < 0,05).

Hình ảnh dựa trên huỳnh quang của chức năng con đường glymphatic.

Thể tích nhu mô não biểu hiện sự thay đổi tín hiệu (T1 rút ngắn) khi tiêm thuốc cản quang vào vỏ ở chuột bị hạn chế hơn đáng kể so với sự xâm nhập của chất đánh dấu CSF huỳnh quang vào nhu mô não được phát hiện bằng hình ảnh dựa trên huỳnh quang ở chuột ( 6 ). Chúng tôi phỏng đoán rằng sự khác biệt này xuất phát từ sự khác biệt về tổng lượng chất tương phản được truyền vào bên trong vỏ não, kết hợp với độ nhạy tương đối (so với hình ảnh dựa trên huỳnh quang) của MRI có trọng lượng T1 để phát hiện những thay đổi tín hiệu gây ra bởi nồng độ chất tương phản thấp khi phân tán khắp não nhu mô. Để kiểm tra điều này, chúng tôi đã tiêm đồng thời dextran huỳnh quang (dextran liên hợp FITC [FITC-d500] và TR-d3; MW 500 kDa và 3 kDa tương ứng) theo cùng một giao thức được sử dụng cho nghiên cứu MRI và đánh giá các lộ trình cũng như mức độ thâm nhập của chất đánh dấu vào não bằng kính hiển vi huỳnh quang ex vivo.

Khi chụp ảnh ở công suất thấp (×4) bằng kính hiển vi phát quang thông thường, sự phân bố tổng chất đánh dấu huỳnh quang hoàn toàn phù hợp với kết quả của nghiên cứu MRI. Ba mươi đến sáu mươi phút sau khi truyền chất đánh dấu, nhãn huỳnh quang cường độ cao hiện rõ bên dưới bề mặt màng trong toàn bộ não ​(Hinh 4,4, A và F). Cường độ chất đánh dấu là lớn nhất dọc theo bề mặt bụng não và dọc theo rìa của hốc quả tùng khi nó kéo dài vào não và kết nối với khe nứt vùng đồi thị. Tại những vị trí này, sự thâm nhập của chất đánh dấu CSF vào mô chủ yếu phụ thuộc vào kích thước phân tử, vì TR-d3 có trọng lượng phân tử nhỏ dễ dàng đi vào nhu mô từ khoang dưới nhện, trong khi FITC-d500 có trọng lượng phân tử lớn không thâm nhập ra ngoài bề mặt màng nhện ( Nhân vật ​(Hinh 4,4, A và F).

Hình 4: Hình ảnh dựa trên huỳnh quang của trao đổi CSF-ISF cạnh mạch máu.

Các chất đánh dấu huỳnh quang trọng lượng phân tử nhỏ (TR-d3; MW 3 kDa) và lớn (FITC-d500; MW 500 kDa) đã được tiêm vào bên trong vỏ và chụp ảnh ex vivo bằng kính hiển vi huỳnh quang đồng tiêu quét thông thường và quét laser. 

(A , B , F và H) Các đoạn phim toàn lát cắt đã được tạo ra, cho thấy chất đánh dấu CSF cạnh mạch máu (đầu mũi tên) xâm nhập vào não ở (A và B) 30 phút, (F) 60 phút và (H) 180 phút sau mũi tiêm. (B) Máy đếm lát cắt vành được dán nhãn isolectin B4 (IB4) nội mô mạch máu 30 phút sau khi tiêm. (C và D) Hình ảnh đồng tiêu năng lượng cao cho thấy chất đánh dấu CSF đi vào não dọc theo các động mạch xuyên qua (đầu mũi tên) (E) nhưng không dọc theo các tĩnh mạch dẫn lưu. FITC-d500 trọng lượng phân tử lớn vẫn bị giới hạn trong các khoang cạnh mạch máu, trong khi TR-d3 trọng lượng phân tử nhỏ dễ dàng di chuyển vào và xuyên qua các kẽ xung quanh. (F) 60 phút sau khi tiêm, TR-d3 trọng lượng phân tử nhỏ nằm rải rác khắp các kẽ não, (G) trong khi FITC-d500 trọng lượng phân tử lớn hiện rõ dọc theo giường mao mạch cuối. Hình nhỏ mô tả phép chiếu z của ngăn xếp hình ảnh, thể hiện mức độ ghi nhãn mao mạch với FITC-d500. (H) Ở thời điểm 180 phút sau khi tiêm, nồng độ chất đánh dấu trong nhu mô giảm so với 30 và 60 phút sau khi tiêm, (I) trong khi chất đánh dấu trong vỏ vẫn tồn tại dọc theo con đường thanh thải cạnh tĩnh mạch. Độ phóng đại ban đầu (các phép đo trên thanh tỷ lệ được hiển thị trong ngoặc đơn): ×40 (A , B , F và H); ×200 (100 m) (C); ×400 (50 μm) (D , E , G , và I và các phần lồng trong D , E và G); ×40 (chèn vào, I).

Vào lúc 30 phút sau khi tiêm, dòng dịch não tủy tràn vào não đã thấy rõ ​(Hinh 4,4, A và B). Theo quan sát trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi trên chuột ( 6 ), dòng chảy cận mạch hầu như chỉ xảy ra dọc theo các khoảng trống xung quanh các động mạch xuyên thấu (Hinh 4,4, C và D) chứ không phải dọc theo tĩnh mạch ​(Hình 4E).4Đ). Điều này bao gồm các động mạch vỏ não xuyên thấu nhỏ hơn cùng với các động mạch cỡ lớn bắt nguồn từ bề mặt bụng não. Phù hợp với sự khác biệt trong phân phối được quan sát giữa Gd-DTPA và GadoSpin, phân phối TR-d3 và FITC-d500 qua não có sự khác biệt rõ rệt. Vào lúc 30 phút sau khi tiêm, FITC-d500 vẫn bị giới hạn ở các khoang cạnh mạch và không đi vào nhu mô xung quanh. Ngược lại, TR-d3 dễ dàng lan truyền từ các khoang cạnh mạch vào nhu mô xung quanh và được các tế bào thần kinh gần đó hấp thụ (Hinh 4,4, C và D).

Những thay đổi tín hiệu do Gd-DTPA gây ra trong nhu mô đạt đỉnh điểm trong khoảng từ 60 đến 80 phút sau khi tiêm ​(Hình 2,2, C–F) và sau đó giảm dần khi chất cản quang bị loại bỏ khỏi nhu mô não. Trong khoảng từ 30 đến 60 phút sau khi tiêm, huỳnh quang TR-d3 trên toàn bộ não dường như tăng lên khi chất đánh dấu lan ra từ bề mặt màng mềm ở đầu gần và các con đường cạnh mạch máu để phân bố rải rác khắp nhu mô ​(Hinh 4,4, A và F). FITC-d500 vẫn bị giới hạn ở các khoang cạnh mạch máu, kéo dài đến các giường mao mạch khắp não ​(Hình 4G).4G). Vào lúc 180 phút sau khi tiêm, cường độ huỳnh quang não đã giảm từ giá trị ở thời điểm 30 và 60 phút (Hình 4H);4H); tuy nhiên, chất đánh dấu vẫn tồn tại trong các con đường cạnh tĩnh mạch xung quanh gần hốc quả tùng ​(Hinh 44TÔI).

Thảo luận

Gần đây chúng tôi đã báo cáo rằng con đường glymphatic là nhân tố chính góp phần làm sạch amyloid β hòa tan khỏi kẽ não và đề xuất rằng sự thất bại của quá trình thanh thải này có thể góp phần vào sự lắng đọng mảng bám amyloid và tiến triển AD (6). Dựa trên những phát hiện này, có thể có giá trị lớn trong việc phát triển xét nghiệm tiên lượng lâm sàng để đo chức năng đường dẫn bạch huyết trong não người và đánh giá xem liệu việc ức chế hệ thống này có góp phần vào sự phát triển và tiến triển của AD hay không. Ở đây chúng tôi cung cấp dữ liệu bằng chứng về khái niệm chứng minh rằng chức năng đường dẫn glymphatic có thể được đo bằng cách sử dụng kỹ thuật hình ảnh đơn giản và phù hợp về mặt lâm sàng, MRI tăng cường độ tương phản, để hình dung sự trao đổi CSF-ISF trên toàn não. Chúng tôi báo cáo rằng sau khi tiêm vào vỏ não, chất cản quang di chuyển nhanh chóng theo dòng chảy lớn qua các con đường cạnh động mạch để đến các nút dòng chính ở hốc tuyến yên, khứu giác và hốc tuyến tùng. Hơn nữa, phân tích dữ liệu tham số và phi tham số về sự thay đổi tín hiệu (rút ngắn T1) trong các vùng khác nhau của nhu mô não chứng minh rõ ràng rằng chuyển động tương phản vào và qua kẽ phụ thuộc nhiều vào trọng lượng phân tử của phân tử tương phản thuận từ. Từ chuỗi hình ảnh MRI tăng cường độ tương phản động, chúng tôi cũng đã phát triển và xác định các thông số động học đơn giản để mô tả chức năng của hệ thống glymphatic phản ánh tốc độ trao đổi CSF-ISF trong toàn bộ não.

Chúng tôi đã báo cáo trong nghiên cứu trước đây rằng dịch não tủy dưới nhện nhanh chóng xâm nhập vào nhu mô não dọc theo các kênh cận mạch bao quanh các động mạch xuyên thấu ( 6 ). Những phát hiện hiện tại của chúng tôi chứng minh rằng các động mạch bề mặt não bên ngoài, chẳng hạn như động mạch nền, động mạch thông của Vòng Willis và động mạch khứu giác, tạo thành con đường vận chuyển nhanh chóng cho CSF ​​trong khoang dưới nhện rộng hơn và cuối cùng là não. Về mặt giải phẫu, các con đường vận chuyển CSF này có thể tương ứng với các bao quanh mạch máu màng não mô mềm được mô tả trong các nghiên cứu kính hiển vi điện tử của Weller và các đồng nghiệp ( 9 – 11 ). Cả độ tương phản trọng lượng phân tử nhỏ (<1 kDa) và lớn (~200 kDa) đều di chuyển qua các khoảng không gian động mạch này với tốc độ tương đương nhau, cho thấy dòng chảy khối đang thúc đẩy sự vận chuyển dòng CSF dọc theo các con đường này ( 7 , 12 , 13 ). Phân tích dòng chất đánh dấu có nhãn huỳnh quang xâm nhập vào não chuột đã xác nhận rằng các đường dẫn dòng chảy lớn xung quanh các động mạch bề mặt là liên tục với các động mạch thâm nhập nhỏ hơn xung quanh và cung cấp một con đường trực tiếp cho dòng CSF xâm nhập nhanh chóng vào và qua kẽ não. Những con đường dòng chảy lớn qua động mạch này bao gồm thành phần chính của hệ thống toàn bộ não tạo điều kiện thuận lợi cho việc loại bỏ các chất hòa tan và chất thải từ kẽ não.

Sự trao đổi CSF và ISF giữa các khoang cạnh mạch máu và kẽ xảy ra ở các chân tận của tế bào hình sao quanh mạch máu, mở rộng phạm vi bao phủ gần như hoàn toàn lên vi mạch não ( 8 ). Kết quả là, các chất hòa tan thiếu con đường vận chuyển phân tử cụ thể (chẳng hạn như các chất vận chuyển ion hoặc các kênh) qua các chân cuối thay vào đó phải đi qua khe hở khoảng 20nm giữa các quá trình chân cuối chồng chéo để có thể tiếp cận với không gian kẽ. Trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi trên chuột, chúng tôi đã báo cáo rằng các chất đánh dấu nhỏ như TR-d3 (đường kính hydrat hóa [d _H ] = 6,1 nm; ref. 14 ) dễ dàng đi vào và xuyên qua kẽ, trong khi các chất đánh dấu lớn như FITC-d2000 ( d _H > 32 nm; ref. 14 ) vẫn chủ yếu giới hạn ở các khoang cạnh mạch máu ( 6 ). Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác nhận những phát hiện này ở chuột bằng cách sử dụng hình ảnh dựa trên huỳnh quang. Ngoài ra, chúng tôi đã sử dụng 2 chất tương phản có kích thước khác nhau là Gd-DTPA (MW ~ 1 kDa) và GadoSpin (MW 200 kDa) để chứng minh tác dụng tương tự của kích thước chất đánh dấu bằng MRI tăng cường độ tương phản động. Ví dụ, khi so sánh TAC của 2 chất tương phản ở các vị trí giải phẫu khác nhau, GadoSpin có trọng lượng phân tử lớn đi vào nhu mô não với tốc độ thấp hơn đáng kể so với Gd-DTPA có trọng lượng phân tử nhỏ (so sánh các đường cong màu đỏ và xanh lam, Hình​Hình 2).2). Hơn nữa, một phân tích cụm độc lập đã tiết lộ rõ ​​ràng rằng mặc dù cả hai máy theo dõi đều có quyền truy cập sẵn sàng vào các không gian cạnh mạch máu, nhưng thể tích não mà Gd-DTPA có thể tiếp cận được lớn hơn rõ rệt so với thể tích mà GadoSpin truy cập (so sánh vùng màu xanh lam 3 trong Hình​Hình3D3D với điều đó trong Hình​Hình 3H).3H). Mặc dù chúng tôi cho rằng sự khác biệt quan sát được trong kiểu trao đổi CSF-ISF giữa Gd-DTPA và GadoSpin là do sự khác biệt về kích thước phân tử, chúng tôi thừa nhận rằng có những khả năng khác tồn tại. Ví dụ, có thể hình dung rằng các đặc tính phân tử nội tại khác, chẳng hạn như hình dạng, lực tĩnh điện, kích thước (bán kính hồi chuyển), hình dạng hoặc tương tác vật lý/hóa học, có thể góp phần tạo ra các kiểu trao đổi CSF-ISF khác nhau được quan sát thấy với 2 phân tử tương phản. . Rõ ràng, sẽ cần nhiều nghiên cứu hơn bằng cách sử dụng một loạt các phân tử tương phản có đặc tính tốt để làm rõ đầy đủ vấn đề này.

Một sự khác biệt rõ ràng giữa hình ảnh dựa trên MR dựa trên huỳnh quang và tăng cường độ tương phản theo giao thức thử nghiệm hiện tại là không thể phát hiện chất tương phản trọng lượng phân tử nhỏ (Gd-DTPA) trong toàn bộ nhu mô não sau khi tiêm vào trong vỏ. Điều này trái ngược với việc dán nhãn nhu mô rộng rãi bằng các chất đánh dấu CSF huỳnh quang có trọng lượng phân tử nhỏ ở chuột ( 6 ). Để xác nhận rằng những khác biệt này không phản ánh sự khác biệt giữa các loài trong quá trình trao đổi CSF-ISF, chúng tôi đã tiến hành chụp ảnh huỳnh quang ex vivo trên các lát não chuột sau khi tiêm vào trong vỏ các chất đánh dấu CSF huỳnh quang có kích thước tương tự (so sánh FITC-d500 [500 kDa] với GadoSpin [200 kDa] và so sánh TR-d3 [MW 3 kDa] với Gd-DTPA [MW ~1 kDa]) bằng cách sử dụng giao thức tiêm giống hệt với giao thức được sử dụng cho các thí nghiệm MRI. Hình ảnh dựa trên huỳnh quang này đã xác nhận sự thẩm thấu của chất đánh dấu CSF trọng lượng phân tử nhỏ khắp nhu mô não chuột và hạn chế chất đánh dấu trọng lượng phân tử lớn vào các khoảng trống cạnh mạch máu. Do đó, chúng tôi kết luận rằng Gd-DTPA, giống như TR-d3, trên thực tế di chuyển khắp nhu mô não. Tuy nhiên, nồng độ tương phản Gd-DTPA đạt được theo phác đồ tiêm truyền nội tủy hiện tại trong nhu mô rộng hơn đơn giản là không đủ cao để tạo ra những thay đổi tín hiệu có thể phát hiện được (rút ngắn T1).

Bất chấp những hạn chế này, bản chất 3D nội tại của MRI cho phép hình dung toàn bộ con đường trao đổi CSF-ISF cận mạch trong toàn bộ não, cho phép chúng ta xác định các nút chính của dòng CSF chảy vào não tại hốc tuyến yên, động mạch khứu giác và hốc tuyến tùng và để đánh giá đồng thời sự trao đổi CSF-ISF tại nhiều vị trí khác biệt về mặt giải phẫu ​(Hình 5). Thông qua việc thu nhận hình ảnh động, động học của chất đánh dấu CSF đi vào và giải phóng khỏi các khoảng gian mạch và kẽ có thể được đo và mô tả cho một phân tử tương phản nhất định. Ví dụ, TAC được tạo ra cho hốc tuyến yên dưới nhện và hốc tuyến tùng sau khi tiêm Gd-DTPA có đặc điểm dòng chảy tương tự, trong khi dòng chảy ra từ hốc tuyến tùng chậm lại rõ rệt so với hốc tuyến yên (so sánh ​Hình2A và Hình​Hình 2B). Tương tự, TAC được tạo ra cho tiểu não và cống dẫn nước cho thấy động học dòng vào tương tự nhau, trong khi độ thanh thải của chất cản quang từ ống dẫn nước kéo dài hơn so với vùng tiểu não (so sánh Hình 2).​Hình2C và ​Hình 2E, 2Đ). Một lời giải thích khả dĩ cho việc khoảng trống kéo dài từ hốc quả tùng và ống dẫn nước là các vùng giải phẫu này tạo thành các vị trí khoảng trống ISF chính và do đó dường như giữ được độ tương phản (bằng cách tích lũy nó từ các vùng khác) trong thời gian dài hơn.

Hình 5: Con đường glymphatic trong não của trao đổi CSF-ISF, được đánh giá bằng MRI tăng cường độ tương phản ở chuột.

Sau khi tiêm vào khoang dưới nhện của bể lớn, chất cản quang đi theo con đường cận mạch cụ thể (mũi tên màu vàng) để đi vào nhu mô não và trao đổi với các khoang kẽ (mũi tên và trường màu cam). Việc thu thập chuỗi hình ảnh động đã xác định các nút dòng CSF chính ở các hốc tuyến tùng (Pin) và tuyến yên (Pit) và cho phép rút ra các thông số động học đơn giản làm chệch hướng mức độ và tốc độ trao đổi CSF-ISF glymphatic trên toàn bộ não. Thanh tỷ lệ: 3 mm.

Phân tích dữ liệu chuỗi thời gian động cũng cho phép so sánh cơ bản về trao đổi CSF-ISF giữa một chất tương phản trọng lượng phân tử nhỏ (Gd-DTPA) và lớn (GadoSpin) (so sánh Video bổ sung 1 và 2; Phương pháp bổ sung). Ở đây, điều đặc biệt quan trọng cần lưu ý là, trong hốc tuyến yên, dòng vào và độ thanh thải Gd-DTPA và GadoSpin hầu như giống hệt nhau (so sánh các đường cong màu đỏ và màu xanh, ​Hình 2A) trong khi đó ở nhân nhu mô cầu não, chuyển động của GadoSpin vào và qua khu vực này đã giảm đáng kể so với Gd-DTPA (so sánh các đường cong màu đỏ và xanh lam, ​Hình 2F). Sử dụng cách tiếp cận thứ hai, phân tích cụm, mô hình phân bố không gian trao đổi CSF-ISF giữa 2 chất tương phản có thể được đánh giá ở cấp độ của cống dẫn nước. So sánh thể tích não thô bị chiếm giữ bởi vùng 3 (tương ứng với ngăn xa nhất) hoặc vùng 3 trung bình được chuẩn hóa _{. voxels × AUC} /vùng 1 _{không. Tỷ lệ voxels × AUC} (phản ánh sự thâm nhập của chất đánh dấu từ khoang cận mạch vào nhu mô não), sự thâm nhập của GadoSpin vào và qua kẽ não bị hạn chế đáng kể so với Gd-DTPA (Bảng 2). Do đó, MRI tăng cường độ tương phản động sau khi sử dụng chất tương phản trong vỏ cung cấp một cách tiếp cận mới và đơn giản để mô tả cả động học và phân bố không gian của quá trình trao đổi CSF-ISF glymphatic trên toàn bộ não.

Trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi ( 6 ), chúng tôi đã báo cáo rằng con đường glymphatic là yếu tố quan trọng góp phần làm sạch các chất hòa tan kẽ như amyloid β hòa tan, một peptide được nhiều người cho là yếu tố quan trọng trong sinh bệnh AD ( 15 , 16 ). Dựa trên những phát hiện đó, chúng tôi đề xuất rằng sự thất bại của chức năng con đường glymphatic có thể góp phần vào sự lắng đọng các mảng amyloid β và sự tiến triển của AD. Động lực chính để đánh giá chức năng đường dẫn glymphatic bằng MRI tăng cường độ tương phản ở chuột là đặt nền tảng thực nghiệm để đánh giá chức năng đường dẫn glymphatic trong não người và trong tương lai đánh giá xem liệu sự thất bại của nó có góp phần vào sự tiến triển của AD ở người hay không. Để thực hiện điều này, cần phải có một phương pháp chụp ảnh an toàn, xâm lấn tối thiểu để đo chức năng đường dẫn khí. Chụp cộng hưởng từ bể chứa thuốc cản quang hiện đang được sử dụng trên lâm sàng để hình dung rò rỉ dịch não tủy ở những bệnh nhân đang điều trị hạ huyết áp nội sọ tự phát và chảy nước mũi dịch não tủy ( 4 , 5 ), và Gd-DTPA được sử dụng trong nghiên cứu này đã được phê duyệt lâm sàng cho mục đích này. Mặc dù đường tiêm hiện tại qua bể chứa nước lớn và thời gian quét cần thiết (> 2 giờ) không phù hợp về mặt lâm sàng, nhưng nhóm của chúng tôi đang tiến hành đánh giá tính phù hợp của việc tiêm một mũi duy nhất vào vùng thắt lưng để đánh giá chức năng đường dẫn glymphatic trong não. Chúng tôi đang phát triển thêm các phương pháp để giảm thời gian thu thập và quét dữ liệu. Tuy nhiên, nghiên cứu này chứng minh rằng, ở chuột, phương pháp có khả năng được chấp nhận về mặt lâm sàng này có thể được sử dụng để hình dung và đánh giá chức năng của con đường glymphatic, cho phép đánh giá động học và mô hình phân bố giải phẫu của trao đổi CSF-ISF cận mạch trên toàn bộ não. Chúng tôi đề xuất rằng phương pháp này có thể cung cấp cơ sở cho một chiến lược tiên lượng hoàn toàn mới để đánh giá tính nhạy cảm của AD và tiến triển bệnh trong tương lai.

Giao thức MRI.

Sau phẫu thuật, những con chuột được lật ngửa và đặt trong một chiếc nôi acrylic tùy chỉnh được trang bị thiết bị cố định đầu và mặt nạ mõm để cung cấp oxy bổ sung. Đầu của con vật được đặt trên một cuộn dây thu tần số vô tuyến dài 3,0 cm được chế tạo riêng. Các thiết bị theo dõi không xâm lấn, tương thích với MRI (đo độ bão hòa oxy trong mạch, nhịp thở và đầu dò nhiệt độ trực tràng; SA Instruments Inc.) đã được thay đổi vị trí để theo dõi liên tục các dấu hiệu quan trọng trong khi con vật được chụp MRI. Trong quá trình chụp ảnh, nhiệt độ cơ thể được giữ nghiêm ngặt trong khoảng 36,5°C đến 37,5°C trong khi chụp ảnh bằng hệ thống sưởi ấm không khí có sự hỗ trợ của máy tính (SA Instruments Inc.). Ống thông nội tủy được nối với một dây PE 20 dài được phủ chất tương phản MR thuận từ được pha loãng trong NaCl 0,9% gắn vào ống 1 cc. ống tiêm và bơm truyền vi sinh (Bơm truyền dịch Baxter Model AS50, Baxter Healthcare Corporation). Ống thông tĩnh mạch đuôi được sử dụng để duy trì hydrat hóa (0,9% NaCl, 4 cc/kg/h) và gây mê bổ sung (Nembutal, 5–10 mg/kg iv) được thực hiện mỗi 2 giờ theo hướng dẫn của nhịp thở.

Hai chất tương phản thuận từ khác nhau đã được sử dụng cho các thí nghiệm: Magnevist (Gd-DTPA, MW 938 Da; Bayer HealthCare Pharmaceuticals Inc.) và GadoSpin P (MW 200 kDa; Miltenyi Biotec Inc.). Để hình dung các con đường glymphatic bằng MRI tăng cường độ tương phản (hiệu ứng rút ngắn T1), trước tiên cần thiết lập nồng độ ban đầu mà tại đó 2 chất tương phản thuận từ khác nhau phù hợp với nhau để giảm nồng độ được tạo ra theo thời gian trong mô não ở xa vị trí tiêm có thể so sánh được. Nói cách khác, các hiệu ứng T1 gây ra bởi 2 chất tương phản thuận từ rất quan trọng để phù hợp với nhau, vì sau khi chúng được tiêm vào bể chứa lớn, chúng sẽ di chuyển qua các con đường glymphatic khắp não và dần dần bị loãng theo thời gian. Để thực hiện điều này, các thí nghiệm ảo đã được thực hiện (xem các thí nghiệm Phantom MRI trong Phương pháp bổ sung và Hình 1 và 2 bổ sung).

Tất cả các giao thức hình ảnh được thực hiện trên thiết bị MRI 9,4T/20 giao tiếp với bảng điều khiển Bruker Advance và được điều khiển bởi phần mềm Paravision 5.0 (Bruker Bio Spin). Một cuộn dây tần số vô tuyến bề mặt 3 cm tùy chỉnh được sử dụng làm máy thu và một cuộn âm lượng đường kính 16 cm (Bruker) được sử dụng làm máy phát. Sau khi quét trinh sát giải phẫu định vị, chuỗi FLASH có trọng số 3D T1 (TR = 15 ms, TE = 3,4 ms, góc lật = 15°, NA = 1, FOV = 3,0 × 3,0 × 3,2 cm, thời gian quét = 4 phút 5 giây , kích thước ma trận thu nhận 256 × 128 × 128 được nội suy thành 256 × 256 × 256, mang lại độ phân giải hình ảnh 0,12 × 0,12 × 0,13 mm) được thu được trong mặt phẳng dọc hoặc mặt phẳng vành. Đối với tất cả các thí nghiệm, bóng ma Gd-DTPA 60 mM (tỷ lệ thể tích 1: 8 được pha loãng trong 0,9% NaCl) được đặt ở vùng lân cận đầu động vật đã được sử dụng để chuẩn hóa cường độ hình ảnh theo chuỗi thời gian. Giao thức quét bao gồm 3 lần quét cơ bản, sau đó là phân phối độ tương phản thuận từ nội mô (0,17 mM GadoSpin và 21 mM Gd-DTPA) qua ống thông bên trong trong khi tiếp tục thu nhận MRI. Tổng cộng 80 μl chất tương phản thuận từ được truyền vào bên trong vỏ não với tốc độ truyền 1,6 μl mỗi phút (tổng thời gian truyền = 50 phút). Sau khi hoàn thành việc truyền vào trong vỏ, việc thu nhận MRI 3D tiếp tục trong hơn 3,9 giờ. Vào cuối cuộc thí nghiệm, con vật bị chết do dùng Nembutal quá liều.

Xử lí dữ liệu.

Quy trình xử lý MRI chung bao gồm hiệu chỉnh chuyển động của đầu, chuẩn hóa cường độ, làm mịn và chuyển đổi từng điểm ảnh ba chiều thành phần trăm của tín hiệu cơ bản. Để làm điều này, chúng tôi đã sử dụng SPM8 ( http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/ ). Đầu tiên, hình ảnh MRI có trọng số T1 thu được được xuất dưới dạng tệp DICOM và được chuyển đổi sang định dạng hình ảnh 3D NIfti. Thứ hai, việc đăng ký sai giữa các lần quét do chuyển động của đầu đã được sửa chữa bằng cách căn chỉnh cơ thể cứng nhắc của mỗi lần quét với hình ảnh (trung bình) theo thời gian. Thứ ba, cường độ hình ảnh được chuẩn hóa theo chuỗi thời gian bằng cách chia cường độ voxel cho cường độ trung bình của bóng ma tham chiếu bằng cách sử dụng biểu thức sau: img_normalized = img_origen/phantom × 1.000, trong đó img_normalized là viết tắt của cường độ hình ảnh được chuẩn hóa và img_origen là viết tắt của hình ảnh gốc cường độ, tiếp theo là toàn bộ chiều rộng 0,1 mm ở mức tối đa một nửa cường độ hình ảnh đẳng hướng Gaussian voxel-khôn ngoan. Cuối cùng, để đảm bảo rằng cường độ điểm ảnh ba chiều biểu thị phần trăm thay đổi so với các hình ảnh cơ sở trung bình, tất cả các hình ảnh chuỗi thời gian được trừ và chia cho hình ảnh trung bình cơ sở bằng cách sử dụng biểu thức sau: P ( i , j , k ) = [ I ( i , j , k ) – base( i , j , k )]/base( i , j , k ) × 100, trong đó P là phần trăm thay đổi tín hiệu so với đường cơ sở, I là cường độ hình ảnh và ( i , j , k ) là viết tắt của vị trí voxel.

Những thay đổi tín hiệu được đo trên MRI có trọng số T1 theo thời gian ở các vùng giải phẫu được chọn trước đã được sử dụng để thu được TAC của sự hấp thu mô trong vùng của các chất tương phản thuận từ. Các hình ảnh cơ bản trung bình theo trọng số T1 cũng như các ảnh MRI có trọng lượng T1 được tăng cường độ tương phản được sử dụng để hướng dẫn về mặt giải phẫu vị trí của ROI. Từ các MRI dọc gần đường giữa, ROI được vẽ trên 4 lát cắt dọc ở mỗi bán cầu và tín hiệu từ mỗi ROI giải phẫu được tính trung bình bằng phần mềm PMOD (PMOD phiên bản 3.307; PMOD Technologies Ltd.). ROI bao gồm hốc tuyến yên, hốc tuyến tùng, khứu giác, tiểu não, nhân cầu não và ống dẫn nước. TAC cho mỗi ROI được trích xuất thông qua mô-đun PKMod. AUC cho TAC của mỗi ROI được tính toán bằng cách sử dụng “quy tắc hình thang” (để biết thêm chi tiết, xem Phương pháp bổ sung). AUC tính toán được chuẩn hóa bằng cách chia AUC của mỗi con vật cho số khoảng thời gian tương ứng được sử dụng cho nghiên cứu cụ thể đó, được gọi là mAUC và được tính là mAUC = AUC/( n – 1), trong đó n là số lượng các khoảng thời gian tương ứng. Hơn nữa, để giảm thiểu sự khác biệt tiềm ẩn về lượng tương phản thuận từ được cung cấp cho từng động vật trong các nhóm, mAUC của hốc tuyến yên (đại diện cho đầu vào chính và nguồn tương phản) đã được sử dụng để bình thường hóa mAUC của các vùng khác. Sau đó, chúng tôi so sánh tỷ lệ mAUC giữa 2 nhóm cho từng vị trí giải phẫu bằng phép thử t độc lập 2 mặt .

Phân tích cluster.

Việc phân đoạn không tham số để nhóm các điểm ảnh ba chiều trong hình ảnh MRI trên cơ sở động học tương tự đã được thực hiện bằng thuật toán cụm k-mean (PMOD phiên bản 3.307; PMOD Technologies Ltd.) trên 4 lát cắt sagittal ở cấp độ của ống dẫn nước từ mỗi 4D T1 – MRI có trọng số. Một mặt nạ khối lượng quan tâm chỉ chứa bộ não được tạo ra để phân tích cụm. Số lượng cụm ( K ) được sử dụng được xác định bởi K có khả năng phân chia các điểm ảnh ba chiều liền kề với các mạch lớn, chẳng hạn như động mạch nền (bao gồm cả hốc tuyến yên) và phức hợp động mạch khứu giác. Điều này được thực hiện trên cơ sở tương tác, trên cơ sở từng con vật. Mỗi phân tích được thực hiện bằng cách sử dụng ngưỡng phân vị 50% (tức là chỉ 50% số pixel có tín hiệu thay đổi cao nhất [tổng giá trị TAC bình phương] được sử dụng). Số cụm cung cấp hình ảnh lý tưởng nhất về các ống dẫn vào cạnh mạch máu là 4 cụm. 4 cụm được kiểm tra trực quan và được đồng bộ hóa với các ảnh MRI giải phẫu và tăng cường độ tương phản tương ứng để xác minh vị trí của các cụm so với các mạch lớn. Số lượng voxels và TAC cho mỗi cụm đã được trích xuất để xử lý tiếp.

Hình ảnh đánh dấu nội sọ huỳnh quang.

Để đánh giá sự chuyển động của các chất đánh dấu nội sọ vào não chuột với độ phân giải cao hơn, chúng tôi đã tiến hành chụp ảnh huỳnh quang ex vivo của FITC-d500 (MW 500 kDa) và TR-d3 (MW 3 kDa) trong các lát não cố định. FITC-d500 và TR-d3 đã được chọn gần tương ứng với trọng lượng phân tử của Gd-DTPA (MW ~ 1 kDa) và GadoSpin (MW 200 kDa). Tiêm nội sọ được tiến hành như chi tiết ở trên. Hỗn hợp 0,1% FITC-d500 và TR-d3 hòa tan trong dịch não tủy nhân tạo được tiêm vào. 30, 60 và 180 phút sau khi tiêm, động vật được tưới máu qua tim với 4% paraformaldehyde, và não được loại bỏ và cố định qua đêm ở 4°C. Các phần rung dọc 100-μm đã được cắt và gắn với Thuốc thử vàng chống phai màu kéo dài với DAPI (Invitrogen). Một tập hợp con các lát cắt vành được dán nhãn bổ sung với Griffonia đánh dấu biotin (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I Isolectin B4 (một chất đánh dấu nội mô mạch máu; 1:100; Vector Laboratories) qua đêm ở 4°C. Việc phát hiện thứ cấp được tiến hành bằng cách sử dụng streptavidin liên hợp Cy5 (1:250; Jackson ImmunoResearch Inc.). Việc dựng phim toàn bộ lát cắt ba kênh được tạo ra bằng kính hiển vi phát quang thông thường (Olympus) ở công suất mục tiêu × 4 với giai đoạn cơ giới hóa và phần mềm Microlucida (Microbrightfield). Hình ảnh công suất cao được thực hiện ở công suất mục tiêu × 40 bằng kính hiển vi đồng tiêu quét laser (Olympus).

Số liệu thống kê.

Tất cả dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± SD. Phân tích thống kê được thực hiện bằng SAS phiên bản 9.2 (SAS Institute Inc.) và XLSTAT phiên bản 2011 (Addinsoft), với P <0,05 được mô tả là khác nhau đáng kể. Sự khác biệt về sự hấp thu mô khu vực (được biểu thị bằng tỷ lệ trung bình giữa mAUC của ROI giải phẫu và mAUC trung bình của hốc tuyến yên) giữa chuột Gd-DTPA và GadoSpin được so sánh bằng cách sử dụng xét nghiệm t 2 mặt cho các nhóm độc lập. Các tham số sau đây được lấy từ phân tích cụm K nghĩa: (a) tổng số voxels ở mỗi trong số 3 vùng giải phẫu, (b) số cụm có trọng số theo thời gian của mỗi vùng (số voxels × AUC) và (c ) tỷ lệ tổng số cụm có trọng số thời gian của vùng 2 và 3 so với số cụm có trọng số thời gian của vùng 1. Sự khác biệt về giá trị trung bình của từng tham số này thu được từ phân tích cụm giữa chuột Gd-DTPA và GadoSpin được so sánh bằng cách sử dụng thử nghiệm t 2 mặt cho các nhóm độc lập.

Phê duyệt nghiên cứu.

Tất cả các nghiên cứu trên động vật và quy trình thí nghiệm đã được phê duyệt bởi ủy ban chăm sóc và sử dụng động vật của tổ chức địa phương tại Phòng thí nghiệm quốc gia Brookhaven, Đại học Stony Brook và Đại học Rochester và tuân thủ cả Đạo luật phúc lợi động vật và các quy định của Văn phòng phúc lợi động vật trong phòng thí nghiệm.